Inhibition de Staphylococcus epidermidis …

Inhibition de Staphylococcus epidermidis ...

L’inhibition de la staphylococcus epidermidis Biofilm Formation par Herbal thaïlandais traditionnels Recettes utilisé pour le traitement des plaies

1 Faculté de médecine traditionnelle thaïlandaise, Prince of Songkla University, Hat Yai, Songkhla 90110, Thaïlande
Centre-ville 2 Natural Products Research, Université Prince of Songkla, Hat Yai, Songkhla 90110, Thaïlande
3 Département de microbiologie, Faculté des Sciences, Université Prince of Songkla, Hat Yai, Songkhla 90110, Thaïlande

Reçu 14 Avril 2012; Accepté le 11 mai 2012

Sous la direction académique: Victor Kuete

Copyright © 2012 S. Chusri et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous la licence Creative Commons Paternité. ce qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que le travail original est correctement cité.

Abstrait

Le développement de biofilm est un mécanisme clé impliqué dans staphylococcus epidermidis virulence au cours des infections associées aux périphériques. Nous avons cherché à étudier la formation de antibiofilm et mature capacité d’éradication de biofilm d’extraits d’éthanol et d’eau de recettes à base de plantes traditionnelles thaïlandaises dont THR-SK004, THR-SK010, et THR-SK011 contre S. epidermidis. Une souche de référence biofilm formant, S. epidermidis ATCC 35984 a été utilisé comme modèle pour la recherche d’agents anti-biofilm par MTT test de réduction. Les résultats ont montré que l’extrait d’éthanol du THR-SK004 (THR-SK004E) pourrait inhiber la formation de S. epidermidis biofilm sur des surfaces de polystyrène. En outre, les traitements avec l’extrait inhibe efficacement la formation du biofilm de l’agent pathogène sur les surfaces de verre déterminées par microscopie électronique à balayage et coloration au cristal violet. En outre, THR-SK010 extrait d’éthanol (THR-SK010E; 0,63&# X2013; 5&# X2009;&# X3bc; g / ml) pourrait diminuer 30-40&# X25; le développement du biofilm. Près de 90&# X25; d’un 7-day-old biofilm staphylococcique a été détruit après un traitement avec THR-SK004E (250 et 500&# X2009;&# X3bc; g / ml) et THR-SK010E (10 et 20&# X2009;&# X3bc; g / ml) pendant 24&# X2009; h. Par conséquent, nos résultats ont clairement démontré THR-SK004E pourrait empêcher le développement de biofilm staphylococcique, alors que les deux THR-SK004E et THR-SK010E possédaient la capacité d’éradication remarquable sur le biofilm staphylococcique mature.

1. Introduction

staphylococcus epidermidis. un habitant normal de la peau humaine saine et les communautés microbiennes des muqueuses, a émergé comme une cause fréquente de nombreuses infections nosocomiales, survenant principalement chez les sujets immunodéprimés ou les patients avec des dispositifs médicaux implantés [1]. Même si, il a un potentiel pathogène faible, les données provenant de la surveillance européenne a indiqué que staphylocoques à coagulase négative ont été isolés jusqu’à 40&# X25; dans les infections du sang tout en Staphylococcus aureus a été isolé à moins de 20&# X25; [2]. Dans S. epidermidis. la formation de biofilms est considérée comme un mécanisme pathogénique important car elle rend S. epidermidis très résistantes aux antibiotiques conventionnels et les défenses de l’hôte. Cela peut être causé par diffusion lente de ces composés à travers la matrice polymère extracellulaire et la croissance lente des bactéries [3. 4]. biofilm staphylococcique est donc difficile à éradiquer et est une source de nombreuses infections récalcitrantes. À ce titre, de nouvelles stratégies ou des agents plus efficaces présentant une capacité de antibiofilm avec une efficacité clinique et la sécurité sont d’un grand intérêt.

des composés dérivés de plantes médicinales ont augmenté un large intérêt dans la recherche d’agents antibactériens alternatifs en raison de la perception qu’ils sont en sécurité et ont une longue histoire d’utilisation dans la médecine populaire pour le traitement des maladies infectieuses [5]. Les constituants actifs isolés à partir de plantes médicinales ont été intensivement étudiés pour leurs effets antibactériens contre des bactéries planctoniques. Plus important encore, certaines plantes ont été rapportés pour être en mesure d’empêcher la formation d’un biofilm dans certains pathogènes tels que Listeria monocytogenes [6], Pseudomonas aeruginosa [7 ], Streptococcus pyogenes [8], Streptococcus mutans [9], et S. aureus [dix ]. Jusqu’à présent, la plupart des études se sont concentrées sur l’observation de l’activité anti-biofilm des herbes prises comme une unité unique, mais pas en combinaison, par exemple dans des recettes de fines herbes. Aucune attention n’a été accordée à l’activité antibactérienne ou anti-biofilm de recettes à base de plantes traditionnellement utilisées.

Cette étude a donc été entreprise pour étudier la in vitro potentiel anti-biofilm de recettes sélectionnées thaïlandais traditionnels à base de plantes (les) qui ont emporter se traduisent traditionnellement utilisés pour le traitement des plaies et des infections de la peau contre un agent pathogène important biofilm produire, S. epidermidis. La formation d’un biofilm nécessite la fixation des bactéries sur des surfaces solides, le développement des empilements de bactéries et de leur enveloppe dans une grande matrice exopolymériques [3]. A cause de cela, nous avons étudié à la fois le développement anti-biofilm et l’éradication de biofilm mature de recettes.

2. Matériel et méthodes

2.1. Souches bactériennes et leur capacité de biofilm-Forming

Les bactéries utilisées dans cette étude ont été cliniquement isolés résistant à la méthicilline Staphylococcus aureus (SARM) NPRC R001-R005, sensible à la méticilline S. aureus (SASM) NPRC S001-S005, S. aureus ATCC 25923, une souche de biofilm-positive (staphylococcus epidermidis ATCC 35984), et une souche de biofilm négatif (S. epidermidis ATCC 12228).

Afin d’évaluer l’aptitude à la formation d’un biofilm de Staphylococcus spp. colonies bien isolées cultivées pendant une nuit à 37&# XB0; C sur gélose de soja tryptique (TSA, Becton, Dickinson and Company, France) ont été inoculées dans un bouillon de soja tryptique (TSB, Becton, Dickinson and Company) complétée par 2&# X25; (P / p) D-glucose (TSBGlc). Après incubation à 37&# XB0; C 24&# X2009; h; les surnageants de culture provenant de chaque isolât ont été dilués 1&# X2009 ;:&# X2009; 200 TSBGlc. Des portions aliquotes de la suspension bactérienne (200&# X2009;

&# X2009; CFU / mL, concentration finale) ont été transférés dans une plaque à 96 puits en polystyrène microtitrage à fond plat (Nunc, Roskilde, Danemark). Le milieu sans la suspension bactérienne a été utilisée comme témoin négatif. Les plaques ont été incubées à 37&# XB0; C 24&# X2009; h, les surnageants de culture de cellules provenant de chaque puits ont ensuite été décanté et planctoniques ont été éliminés par lavage à trois reprises avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS; pH 7,4) [10].

3- (4,&# X2009;&# X2009; 5-diméthyl-2-thiazolyl) -2,&# X2009;&# X2009; 5-diphényl-2H-tétrazolium bromid&# X2009;&# X2009; (MTT)&# X2009;&# X2009; (Sigma-Aldrich,&# X2009;&# X2009; Etats-Unis) Essai de réduction selon la méthode décrite précédemment [11] a été appliqué pour quantifier la capacité à former un biofilm des isolats. Une aliquote de solution MTT (0,2&# X2009; mg / ml; 200&# X2009; L) a été ajouté à chacun des puits prélavées et la plaque a ensuite été incubée pendant 3&# X2009; h dans l’obscurité à 37&# XB0; C. Après l’incubation, le MTT a ensuite été remplacé par 200&# X2009; L de diméthylsulfoxyde (DMSO, Merck, Darmstadt, Allemagne). Les bactéries avec un système de transport d’électrons actif permettra de réduire le sel de tétrazolium à un produit formazan pourpre insoluble dans l’eau. L’intensité de la couleur de formazan DMSO dissous a été déterminée par un lecteur de microplaques (Tecan Sunrise, Tecan Autriche) à A482&# X2009; nm. Les valeurs d’absorbance pour le contrôle négatif ont ensuite été soustraites des puits testés pour éliminer les faux résultats en raison de l’interférence de fond.

2.2. Préparation à base de plantes de recettes

recettes thaïlandaises sud sélectionnés à base de plantes qui ont été utilisés pour le traitement des plaies et des infections de la peau ont été aimablement fournies par M. Gagnez Thongsongsi (THR-SK004) [12] et M. Somporn Chanwanisakul (THR-SK010 et THR-SK011), un classique Thai Médecin à l’hôpital traditionnel thaïlandais de médecine, Université prince of Songkla, Hat Yai, en Thaïlande. Les parties de plantes telles que décrites dans le tableau 1 ont été recueillies localement et les spécimens de référence ont été déposés à la Faculté de médecine traditionnelle thaïlandaise, Prince of Songkla University, Hat Yai, Songkhla, Thaïlande. Les préparations en poudre (100&# X2009; g) ont été soumis à un solvant extractions par macération avec de l’eau distillée à la température ambiante pendant trois jours ou avec de l’éthanol pendant sept jours (500&# X2009; mL chaque solvant). Après filtrations par un no Whatman. 1 papier filtrats aqueux ont été lyophilisés et les filtrats de l’éthanol ont été concentrées en utilisant un évaporateur rotatif, et on maintient à 55&# XB0; C jusqu’à ce qu’ils étaient complètement secs. Les rendements (&# X25 ;; w / w) de chaque extraits ont été calculés comme le rapport entre le poids de l’extrait au poids de la poudre d’herbes brut et présentés dans le tableau 1. lyophilisés extraits d’eau (THR-SK004W, THR-SK010W et THR-SK011W) et évaporés extraits d’éthanol (THR-SK004E, THR-SK010E et THR-SK011E) ont été dissous dans 10&# X25; (DMSO, Merck, Allemagne) avant utilisation.

Tableau 1: La cicatrisation des plaies liées à des activités biologiques, des composants à base de plantes, et les rendements d’extraction de recettes à base de plantes sud de la Thaïlande sélectionnés.

2.3. L’inhibition de la formation staphylococcique biofilm par les recettes à base de plantes.

Les extraits de la recette à base de plantes ont été testées pour leur capacité à empêcher la formation de biofilm d’une souche biofilm production, S. epidermidis ATCC 35984. Ils ont été ajoutés au milieu de croissance au moment de l’inoculation et les cellules ont été autorisés à former un biofilm. Une aliquote de dilutions en série de doubles (100&# X2009; L) a été préparé de la plaque de microtitrage à 96 puits contenant TSBGlc, avec des concentrations finales de THR-SK004W, THR-SK010W, THR-SK011W, THR-SK004E et THR-SK011E allant de 15,63 à 2501&# X2009; g / mL et de 0,63 à 250&# X2009; g / mL pour THR-SK010E. suspensions bactériennes (100&# X2009; L; &# X2009; UFC / ml, concentration finale) ont ensuite été transférés dans la plaque. TSBGlc contenant 0,2&# X25; DMSO a été utilisé comme témoin négatif. TSBGlc sans l’extrait a été utilisé comme puits non traitée et le milieu avec chaque concentration des extraits a été utilisé comme témoin à blanc [13].

Après incubation à 37&# XB0; C 24&# X2009; h, l’effet des extraits sur la croissance de S. epidermidis a été évaluée à l’aide du lecteur de microplaques à une densité optique de 620&# X2009; nm (

). La formation d’un biofilm de S. epidermidis ATCC 35984 en présence des extraits de la recette à base de plantes a été ensuite déterminée en utilisant le test de réduction du MTT comme déjà indiqué.

2.4. Biofilm dépendant du temps Essai d’inhibition

Selon l’inhibition de l’anti-biofilm, extrait d’éthanol THR-SK004 (THR-SK004E) a été sélectionné pour une expérience. Le développement de biofilm de S. epidermidis après avoir été traité avec cet extrait efficace à des concentrations de 250 et 500&# X2009; g / mL a été observée toutes les 12&# X2009; h pendant 2 jours en utilisant le test de réduction du MTT comme décrit ci-dessus.

2.5. Observation sur la formation de biofilm par microscopie électronique à balayage

En outre, la microscopie électronique à balayage (MEB) images ont été prises pour confirmer la prévention de la formation de biofilm par THR-SK004E [14]. En bref, cette souche a été autorisée à se développer sur des lames de verre carré ( &# X2009; cm) placés dans des plaques de polystyrène à 24 puits (Greiner Bio-One, France) supplémenté avec TSBG1c contenant l’extrait à 250 et 500&# X2009; g / ml suivie par une incubation à 37&# XB0; C 48&# X2009; h. Après l’enlèvement du support et le lavage, les échantillons ont été fixés initialement à 2,5&# X25; glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate à 90&# X2009; min, puis lavé deux fois avec un tampon de cacodylate et déshydratées pour 10&# X2009; min en utilisant une série d’éthanol gradué. Une procédure de séchage au point critique a été suivie, et les échantillons ont ensuite été revêtu par pulvérisation avec de l’or. Les échantillons ont été examinés avec un microscope électronique à balayage (5800LV, JEOL, Japon).

A côté, les morceaux de verre de biofilm ont été lavées trois fois avec du PBS et colorées avec 1&# X25; (P / v) de solution de cristal violet [15]. La formation d’un biofilm sur les pièces en verre teinté a été dissous avec du DMSO et quantifié en mesurant l’absorbance à 620&# X2009; nm en utilisant un lecteur de microplaques.

2.6. Eradication de Établi staphylococcique biofilm par les recettes à base de plantes

biofilms statiques ont été cultivées pendant sept jours comme décrit précédemment [16]. Comme précédemment, la culture bactérienne a été préparée et mise à incuber à 37&# XB0; C 24&# X2009; h. les cellules planctoniques dans le milieu de culture ont ensuite été retirés et frais TSBGlc ont été ajoutés. Cette procédure a été répétée tous les jours pendant sept jours consécutifs. A la fin des 7 jours de croissance d’un biofilm, le milieu et les cellules ont été doucement aspiré planctoniques. Ensuite, 200&# X2009; L de PBS contenant des concentrations différentes de l’THR-SK004E (250 et 500&# X2009; g / mL en concentrations finales) ou THR-SK010E (10 et 20&# X2009; g / ml en concentration finale) ont été ajoutés dans les puits. Eradication de staphylocoques-préformé biofilm par l’extrait a été mesurée à des intervalles choisis de temps de 1, 3, 6, 12 et 24&# X2009; h par l’essai de réduction du MTT, comme expliqué ci-dessus. Le tampon sans agents antimicrobiens a été ajouté aux puits témoins positifs de biofilm. Le pourcentage de l’éradication de biofilm par rapport aux puits non traités a été calculée en utilisant l’équation

3. Résultats

S. epidermidis ATCC 35984 a été utilisé comme un modèle isoler pour le dépistage primaire de la capacité anti-biofilm des extraits d’eau et d’éthanol préparés à partir des recettes à base de plantes traditionnelles. Les rendements d’extraction de trois recettes à base de plantes sélectionnées, y compris THR-SK004 et THR-SK010 utilisés pour la cicatrisation des plaies et THR-SK011 utilisés pour le traitement de l’abcès et fait état d’activités biologiques de leurs composants à base de plantes sont résumées dans le tableau 1.

Afin d’étudier l’effet des recettes sur S. epidermidis la formation de biofilms, la relation entre les posologies et l’activité métabolique des cellules dans le biofilm a été contrôlée (figure 1). Les résultats de l’essai de réduction du MTT a montré que THR-250 à SK004E&# X2009; g / mL pourrait inhiber la formation de S. epidermidis biofilm. THR-SK010E (5&# X2013; 0,63&# X2009; g / ml) pourrait diminuer 30-40&# X25; d’un biofilm staphylococcique. Il est à noter que les concentrations efficaces à la fois THR-SK004E et THR-SK010E n’a pas affecté la croissance des cellules planctoniques. Par ailleurs, THR-SK004E à des concentrations 125 et 250&# X2009; g / ml est capable d’inhiber la formation de biofilm de S. epidermidis sur des surfaces de polystyrène sur une 48&# X2009; h période telle que représentée sur la figure 2.

Figure 1: Effet de différentes concentrations de THR-SK004 (a), Thr-SK010 (b) et THR-SK011 (c) de l’éthanol (-&# X26ab; -,&# X25a0;), et de l’eau (-o-, &# X25a1;) extrait sur la croissance bactérienne (graphiques linéaires) et la formation de biofilm (cartes de colonne) de staphylococcus epidermidis ATCC 35984.

Figure 2: Développement de staphylococcus epidermidis ATCC 35984 biofilm (cartes de colonne) et la croissance bactérienne (graphiques linéaires) après traitement avec THR-SK004 extrait d’éthanol à 125 (symboles gris) et 250&# X2009; g / mL (symboles noirs). Diméthylsulfoxyde à 0,2&# X25; (symboles blancs) a été utilisé comme témoin positif. Chaque symbole indique les moyens&# X2009;&# XB1;&# X2009; erreur standard pour trois expériences indépendantes réalisées en double.

L’inhibition de la formation de biofilms sur des surfaces de verre par THR-SK004E a en outre été visualisé à la fois par SEM et du cristal violet dosage qui est illustré sur la figure 3. Comme prévu, les additions de THR-SK004E à 250 ou 500&# X2009; g / ml, qui a réduit la formation de biofilms sur les surfaces staphylococcique de polystyrène remarquablement inhibé la formation de biofilm de l’agent pathogène sur les surfaces de verre.

Figure 3: micrographies MEB de S. epidermidis ATCC 35984 formation d’un biofilm sur des surfaces de verre. Biofilms ont été cultivées dans TSBGlc (a) ou dans TSBGlc complétés par THR-SK004 extrait d’éthanol à 250, (b) et 500&# X2009; g / ml, (c), et toutes les images présentées ont été prises à un grossissement de 2500x. Les images sélectionnées ont été choisies comme les meilleurs représentants de la quantité de biofilm sur les surfaces de verre. Inhibition du développement d’un biofilm par staphylococcique THR-SK004 extrait d’éthanol a en outre été confirmée par un test au cristal violet (d).

Statique S. epidermidis biofilm ont été cultivées pendant sept jours, puis traité avec THR-SK004E (250 et 500&# X2009; g / ml) et THR-SK010E (10 et 20&# X2009; g / ml). Comme présenté sur la figure 4. plus de 60&# X25; la réduction d’un biofilm statique a été notée dans les films biologiques traitées avec les extraits pour 1&# X2009; h. L’effet des deux extraits était beaucoup plus prononcé avec un plus long régime de traitement. Sensiblement, plus de 90&# X25; des 7 jours d’âge biofilms a été détruit suite à un traitement de 24 h avec THR-SK004E à 500&# X2009; g / mL et THR-SK010E à 10 et 20&# X2009; g / mL.

Figure 4: l’éradication de temps dépendant du biofilm matures formé par S. epidermidis ATCC 35984 après le traitement avec l’extrait d’éthanol THR-SK004 (a) à 250 (&# X26ab; ) Et 500&# X2009; g / mL (&# X25a0;) ou extrait d’éthanol THR-SK010 (b) à 10&# X2009; g / mL (&# X26ab; ) Et 20&# X2009; g / mL (&# X25a0;). Diméthylsulfoxyde à 0,2&# X25; (O) a été utilisé comme témoin positif. Chaque symbole indique les moyens&# X2009;&# XB1;&# X2009; erreur standard pour trois expériences indépendantes réalisées en double.

4. Discussion

Altération de l’adhérence bactérienne et la formation de biofilm par une voie qui n’a pas d’influence sur la croissance bactérienne est une caractéristique pour les thérapies antivirulence, l’une des dernières alternatives prometteuses pour combattre des micro-organismes pathogènes, en particulier S. epidermidis [31]. En plus de l’activité antibactérienne et antibiofilm puissance des plantes médicinales individuelles, les effets des recettes à base de plantes sur S. epidermidis biofilm a été étudiée pour la première fois.

THR-SK004 et ses constituants à base de plantes (Maranta arundinacea. Oroxylum indicum. et Commelina benghalensis ) N’a jamais été jugé pour leur capacité de antibiofilm. Cependant, des extraits d’éthanol de THR-SK004, Commelina benghalensis, et Oroxylum indicum ont proposé d’avoir des activités antistaphylococciques légère à modérée [12. 32. 33]. Le traitement par THR-SK004E a donné lieu à une grande inhibition de la S. epidermidis la formation de biofilm, mais la présence de l’extrait n’a pas influencé la croissance bactérienne. Cette étude démontre que l’extrait de recette inhibe la formation de S. epidermidis à la fois sur surface hydrophobe (polystyrène) et une surface hydrophile (de verre). Les informations suggèrent que l’étude intensive sur THR-SK004E constituants actifs peuvent potentiellement être utilisés comme un outil pour empêcher la formation de biofilms sur les deux dispositifs de médicaments hydrophobes et hydrophiles. De même, les enquêtes précédentes ont laissé entendre que le revêtement de matériaux cliniques avec des substances antimicrobiennes empêche avec succès la colonisation microbienne et la formation de biofilm [10. 13. 34. 35].

Extrait alcoolique de Thr-SK010 est composé de Oryza sativa et d’autres bien documentées, y compris les plantes médicinales Curcuma longa. palmier à bétel. et Garcinia mangostana. Les constituants actifs de Curcuma longa ont été prouvés ou anti-biofilm et dynamisations antiadhérence sur candida albicans [36], Streptococcus mutans [37] Vibrio vulnificus [38], et Pseudomonas aeruginosa [39]. Toutefois, aux concentrations testées (5&# X2013; 0,63&# X2009; g / mL) qui sont inférieures aux valeurs utilisées dans les rapports précédents, THR-SK010 n’a pas inhibé la croissance bactérienne, mais a montré une légère activité antibiofilm. Toutefois, l’anti-biofilm staphylococcique activité de formation d’extraits aqueux des recettes testées et THR-SK011E n’a pas été démontrée. Parmi les composants à base de plantes des recettes, 12 (92,3&# X25;) d’entre eux ont été signalés à posséder la cicatrisation des plaies ou des activités biologiques liées telles que les activités antioxydantes et anti-inflammatoires [40]. En outre, nos résultats concordent avec des preuves de la littérature que l’éthanol est un solvant plus fiable d’extraction de substances antimicrobiennes de plantes médicinales par rapport à l’eau, représentant des préparations thérapeutiquement efficaces actuellement favorisées par les guérisseurs traditionnels [40. 41].

Comme il y a un besoin urgent d’identifier des stratégies thérapeutiques qui sont dirigés vers l’inhibition de biofilm préformé bactérienne, la puissance de l’éradication des extraits efficaces a été évaluée. La présente étude a montré que les deux THR-SK004E et THR-SK010E éliminés avec succès le biofilm établi des S. epidermidis. même à de faibles concentrations de THR-SK010E (10 à 20&# X2009; g / ml). activité biofilm Antipreformed de THR-SK010E est comparable avec des antibiotiques (daptomycine, le linézolide, et tigécycline) [42] ou des composés d’origine végétale dérive (huile d’eucalyptus, 1,8-cinéole [43], l’huile d’arbre à thé [44], farnesol [16 ], l’origan, le carvacrol, le thymol et [10]).

Il y a un besoin critique pour le développement de traitements alternatifs pour lutter contre le nombre croissant d’infections par des agents pathogènes associés multirésistante, en particulier dans les cas où les biofilms sont impliqués. THR-SK004E fortement exposé de formation anti-biofilm de S. epidermidis sur les deux surfaces de polystyrène ou de verre, tandis que les deux THR-THR-SK004E et SK010E remarquablement détruit le biofilm établie.

5. Conclusion

Sur la base de nos résultats, THR-SK004E et THR-SK010E ont des applications prometteuses comme agents de antibiofilm alternatives. Fermer les enquêtes sur l’identification des constituants actifs des recettes et des études efficaces sur les mécanismes impliqués dans l’inhibition de biofilm par les recettes sont donc justifiées et actuellement poursuivis dans notre laboratoire.

Reconnaissance

Ce travail a été soutenu par des subventions pour le développement de nouveaux employés Faculté, Le budget de revenu annuel de Prince of Songkla University (TTM540049S, exercice 2010&# X2013; 2012).

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